在1825年10月，达尔文按照父亲的意愿进入爱丁堡大学学习医学。开始，他对爱丁堡大学充满了幻想，希望好好学习。老达尔文很是欣慰，达尔文总算有机会子承父业了。父亲希望达尔文将来能像他自己那样，既精通医学又懂得生物学。可是，父亲的这一愿望终归还是破灭了。大学期间，达尔文并没有像父亲期望的那样好好学习医学，他结识了高年级研究水生生物的学生罗伯特·格兰特和约翰·科尔斯特里姆。他们都有共同的厌恶与喜好，都对医学不感兴趣，却热衷于水生生物的研究。所以他们经常到海边采集海生动物标本，并且和这一带的渔民交上了朋友，有时，还登上渔船帮助渔民捕捞鱼虾和牡蛎。
这些有趣的活动，使达尔文在童年时代对生物学的热情又复活了。这期间，达尔文对生物学表现出了高度的热情和认真的态度，他积极参加普林尼学生自然史学会的工作以及会议，而且达尔文几乎每场都必到会议进行发言。其中有一次，他就自然分类问题和种类特征问题进行了发言。1827年3月27日，达尔文在普林尼学会上做了有关观察海洋生物的两项报告。
他居然在简陋的显微镜下发现了前人的两个错误：一个是板枝介的幼虫，被前人误认为是借着鞭毛独立运动的板枝介卵；另一个是海蛭的卵衣，被前人误认为是墨角藻幼年期的球状体。他把这两项发现写成了科学论文，初步显示出了他在生物学研究方面的才华。由此，他正式当选为“普林尼学会”（这是爱丁堡大学一个主要研究自然科学的学生组织）的书记。同学们的好评以及朋友们的鼓励，使达尔文研究生物学的热情更高了。
在当时，达尔文学的几门课程，除了托马斯·霍普教授的化学课讲得比较生动外，其他的课全都讲得枯燥乏味。许多教师“填鸭式”的教学方法严重束缚了学生的思想。再有，医学课程的内容甚至比拉丁文还要枯燥无味。达尔文上爱丁堡大学后，亲眼看到一些病人在经过治疗以后，仍然痛苦地死去了，而医生却在一旁束手无策；甚至，医院竟把许多交不起医疗费的病人拒之门外。对此，他不理解医学为什么不能减轻病人的痛苦；更不明白医学这样崇高的职业，为什么也被金钱所左右。
达尔文的天赋也非常不适合学医，他一看到病人流血就恶心呕吐。特别是在上大学二年级时，达尔文进过一次解剖室，解剖台上陈放的尸体虽经处理，仍旧发出难闻的气味，使他恶心不止。达尔文畏惧解剖尸体，而解剖学是医学方面最起码的专业知识。并且当他知道这些尸体都是在爱丁堡济贫院度过余生的穷人时，就再也无法忍受了。医院的日常工作使他厌恶。最使他反感的是做手术。在那个时代，做手术简直像做噩梦，病人的尖叫，满身血污，极度的痛苦……达尔文在手术室里上过两堂这种可怕的课后就再也没有去过。此后，他对学医的选择渐渐地动摇了。他把自己的苦恼坦诚地告诉父亲以后，痛心疾首的父亲彻夜不眠，最后眼睛红红地告诉儿子说：“孩子，走你自己的路吧，我尊重你的选择。”
1827年秋天，达尔文回到家里。
年逾花甲的父亲就要退休了。看到小儿子不想学医，却热衷于打猎和采集标本，原来打算让他继承自己事业的计划不能实现了，不由得恼怒万分，他决定送达尔文去剑桥大学学习神学。达尔文对父亲的这个决定感到非常突然，他小心翼翼地提出了反对意见，但遭到拒绝。
老父亲的理由极其简单：“孩子，读书是为了谋职，而神学院的学生特别容易找到工作，尤其是剑桥一类的名牌大学学生。”而且，达尔文的舅舅乔赛亚·韦奇伍德也极力地开导他：“学好神学，当上了牧师，你对生物学的爱好还是可以坚持下去的。比如哥白尼、布鲁诺、康帕内拉、牛顿，还有剑桥大学教授塞奇威克都学习、研究过神学，有的还担任过圣职。不过我希望你像哥白尼、布鲁诺和康帕内拉那样，从神学走向科学；而不是像牛顿那样，从科学走向神学。”达尔文听说哥白尼、布鲁诺等伟人都学过神学，而且从神学走向了科学，心想自己也可以走这条路。
1828年1月，达尔文正式进入剑桥大学基督学院学习。达尔文虽然从小热爱文学和科学，对神学没有什么兴趣，但他毕竟还是个阅历不深、知识不多的青年，加上无孔不入的神学势力的影响，达尔文一度又产生了做一位乡村牧师的想法。他仔细地阅读了约翰·皮尔逊的《论教义》，佩利的《基督教教义证验论》《自然神学》等神学著作。由于学习努力，达尔文在神学考试中竟然成绩优良，名列前茅。
然而，日久天长，达尔文在神学院的学业开始退步。他的兴趣特别广泛，先是迷上了打猎，后来又迷上了地质学和植物学，后来达尔文本人也承认说：“在剑桥的三年是完全浪费了。”神学院的那种单调枯燥的学习内容，以及一日三次、天天重复的祷告仪式使他越来越厌烦。于是，他把大部分时间用在阅读自然科学书籍以及到野外采集标本的活动上，对神学的兴趣日趋淡薄了。