1927年夏，周祖训汲县师范毕业后，受聘到内黄县楚旺中学附小教书。教学相长，乐趣无穷。但一年后，他深感“教然后知困”的苦恼，便产生了进大学深造的强烈愿望。他商之祖父，祖父同意了他的要求。按当时学制规定：新学制高中毕业生才能直升大学本科；五年制师范毕业生只能升大学预科，然后才能升大学本科。1928年暑假，周祖训到开封报考河南大学预科，结果以高分录取。周祖训上大学预科，是为报考全国名牌大学作准备，所以学习特别努力，学习成绩在班上名列前茅。
1929年暑假，他在报纸上看到南京国立中央大学招生广告规定：“旧制五年制师范毕业生可报考教育学院教育系本科。”周祖训大喜过望，跃跃欲试，一则作教育工作是他的夙愿，再者不须上二年预科了，可早一年大学毕业；惟报考时，须交师范毕业文凭，该文凭当时存在河大注册组。他向注册组索取时，负责人不同意他转学他校，说取走文凭即作为退学处理。周祖训作好破釜沉舟之想，毅然取走文凭，赴南京报考。到南京后积极作考试准备，同时思考万一考不上中大时的补救办法。当时武汉大学在南京设有招考分点，周祖训又报考武汉大学历史系预科。有此补救办法解除后顾之忧，他便一心扑在备考上。结果中大、武大均予录取，他选上了中大教育系。
国立中央大学的前身是东南大学，与北平大学南北对峙，是当时全国著名的两大最高学府。南京国立中央大学院系齐全，有文、理、工、法、教育、农、医、商八院。中大教育学院是学术的海洋。当时全国著名教育专家如郑宗海、孟宪承、俞子夷、陶行知、廖世承、陈鹤琴等，均曾在该院校教过书，后虽陆续离开，但遗风犹存，影响一代又一代人。周祖训在教育学院就读的四年间，院长先后有艾伟、韦悫、程其保等，都是久负盛名的教育家。在教育系任教的名教授，多不胜数。这对周祖训的学习十分有利。他深入学习了十数种必修和选修科目，主要有教育原理、教育行政、学校行政、比较教育、教学法、教育史、中学教育、社会教育、乡村教育、教育调查、教育心理、教育统计学、学科心理学、教育与心理测验、新法考试等。周祖训在大学里学习非常努力。由于他小学、师范学业基础扎实，大学功课一点也不感到吃力，觉得学习是一件愉快的事情。他起早贪黑，珍视分分秒秒，如饥似渴地学习着。上课时，他专心致志听讲，认真作好笔记；自习课，他细心整理课堂笔记，做习题，阅读各科参考书。每科参考书，包括中文和西文，他都选最好的一本，作为精读书。外文学习要查字典，做笔记，他不轻易放过任何一个疑点难点，自我要求达到精通。这样，每科内容精义基本上都能掌握。周祖训别无嗜好，最大的爱好，就是学习、学习、再学习，课余时间爱到学校图书馆。同学们送给他一个亲切的雅号“钻书虫”。
南京中央大学图书馆藏书丰富，古今中外的图书一般都能借到。最令他喜爱的是各科阅览室，图书、杂志、报纸一般都是开架式，可以自由取阅，阅后放回原处。阅览室常人满为患，稍去晚一点就无座位。最难得的是阅览室肃静得无一点声音，出出进进人人蹑手蹑脚。周祖训喜爱读课外书籍，他从课外读物中得到的知识比课堂上学到的还多。报刊上的新知识、新思想使他大开眼界，受益很大。
大凡学习成绩特别优秀的学生，都能受到学校领导和任课教师的关爱和器重。周祖训大学四年间，由于学习成绩特别好，良师益友就特别多。时任中大教育学院院长、教授的艾伟（字险舟），就是其中最突出的一位。艾伟曾留学美国，获博士学位。教学上他对学生要求严格，一丝不苟。周祖训专心致志听讲，聚精会神做习题，收益甚丰。周祖训写的毕业论文《初级小学国语教科书文字分量研究》，学术价值很高，深受艾伟的赏识。艾伟亲自推荐给中央大学实验学校出版的《实验教育》杂志发表。此后，艾伟在他撰写的《高等教育心理学》一书中，曾多处引用周祖训的《初级小学国语教科书文字分量研究》的材料，可见艾伟对此文是何等的重视！艾伟家距学校不远，是一座独院两层小楼。周祖训等优等学生常被邀到他家吃饭，艾夫人亲自下厨做菜，菜虽简单，但吃得很香甜。特别是饭前饭后无拘无束的谈话，从日常生活到学术上的问题，可恣意而谈，这也使他获益匪浅。
周祖训特别尊敬的另一位教师是邰爽秋。邰爽秋曾留学美国，获博士学位，在教育系讲《比较教育》和《教育调查》两门功课。邰精力充沛，讲话热情，富煽动性。他特别推崇苏联的教育。这在当时“谈共色变”的年代里，如此做是很难得的。他鼓励学生阅读当时苏联教育部长品珂微茨写的《苏维埃教育》一书的英译本，打破当时一般人对苏联神秘的看法。在讲授《教育调查》课程时，邰爽秋率周祖训等学生到杭州作实际调查，与学生同吃同住同调查；在调查后共同进行统计、比较、研究，直至写出调查报告。在整个调查过程中，周祖训等既了解到杭州小学的教育实况，也掌握了教育调查方法。邰教授还热心奖掖后学。1932年“一二·八”日寇侵沪战争发生，南京中央大学因受战争影响未能开学，邰爽秋暂到河南大学任教。周祖训也借读河大教育系。在邰爽秋的指导下，其间周祖训曾翻译英文版《教师的品德》一文，在教育刊物《开封》上发表。邰爽秋不仅是著名教授，而且是社会活动家。他为了呼吁政府当局和全社会重视教育，提高教师地位，改善教师生活待遇，保障教师职业等，1931年春，曾奔走于南京、上海等地，倡议每年6月6日为教师节。由于他有理有力的宣传鼓动，得到广大教师和热心教育人士的积极响应，就在当年6月6日，全国不少地方第一次举行了庆祝“教师节”活动。周祖训是当时拥护邰爽秋倡议的最热心者之一，为宣传和筹备举行第一个教师节作了大量默默无闻的工作。
周祖训的求知欲非常旺盛，他不仅把本院本系的必修课、选修课学足学好，而且对别的院系与教育学有关的知识，也全神贯注地学习，兼收并蓄。例如，中大理学院的潘菽、郭一岑、肖孝嵘、郭任远四位教授讲的普通心理学，周祖训都视为必修课，每堂课都去听讲，认真做笔记。郭一岑对周祖训这个旁听生非常器重，热心辅导他作课外研究。周祖训与曹飞同学一面听课，一面合作翻译德国学者编的《游戏心理学》。郭一岑曾帮助他们逐句逐字进行修改。郭一岑在讲授“行为主义心理学”这一课程时，作了杰出实验，常有论文在美国心理学杂志上发表。他为证明小鸡如何在蛋壳内形成啄米的本能，日夜守候在实验室进行观察。这种为真理而探索的精神，对青年周祖训的学习、研究和工作曾产生了很好的影响。
1933年夏，周祖训大学毕业前夕，加入了国民党，成为一名正式国民党员。
在南京中央大学四年间，周祖训不仅获得了丰富的科学文化知识、先进的教育思想理论，而且还结识了很多品学兼优、志同道合的同学，诸如朱宕潜、黄祖瑜、环惜吾、孟昭瓒、李永刚、李映藻、徐祝峰、王子龙等，为其以后从事教育事业和做好统战工作打下了良好的基础。