这一时期最富盛名的作品当属《最后的晚餐》，这幅作品讲述了基督在被捕之前同自己12个信徒诀别的场面。这幅作品现存于米兰圣玛利亚德尔格契修道院的墙壁上，这使得画中的厅堂与现实中的饭厅的建筑结构融为一体，让人们感觉如同这一情景就像发生在自己眼前一样。达芬奇在创作的时候将基督教和他的12个信徒平列在观者面前，将基督置于画作中央，当基督说“你们中间有人出来卖了我”的时候，各个信徒脸上的愤怒、难以置信、沉默、惊恐、慌张的神态展现在观者面前，这样既刻画了人物独特的性格，也深入了绘画主题，与构图相得映彰。1500年，达芬奇回到了佛罗伦萨，这时的佛罗伦萨已经恢复了共和体制，文化气氛空前活跃，这一时期出现了米开朗琪罗和拉斐尔等人，这一时期他为兰则塔大教堂的主祭坛绘制了《圣母子与圣安娜、圣约翰》，在绘制之前他向市民展示了《圣母子与圣安娜、圣约翰》的素描草图，立刻引起了广泛的关注，其中的构图和画法启发了当时的画家，米开朗琪罗和拉斐尔纷纷从这幅画中汲取灵感。1503年，佛罗伦萨市政厅邀请他绘制壁画《安吉里之战》，与此同时他又开始创作《蒙娜丽莎》和《圣母子与圣安娜、圣约翰》这两幅画。这两幅画连同《施洗者圣约翰》一起成为了他一生中最为珍视的三幅画。晚年达芬奇移居法国，也随身将这三幅画带在身边，最终这三幅画也留在了法国。回到佛罗伦萨之后，不久，达芬奇来到了米兰，继续为米兰宫廷服务。之后他又迁至罗马和法国，最终在法国定居，而这期间他并没有进行太多的创作而是进行一些科学实验以及研究一些类似于魔法的小把戏。在罗马，很多人将他视为巫师。晚年达芬奇将工作的重心转移到了科学研究中去，在他死后留下了大量的手稿，其中涉及物理、数学、生物等多个学科，虽然他的画作不是很多，但件件都是精品，而且他善于将艺术与科学融合，这在世界美术史上是绝无仅有的。
在这些画作中，最吸引后世目光的是《蒙娜丽莎》，可以说它是最能体现达芬奇艺术才能的。画中的女人体态丰盈，坐姿端庄，背景的山水朦胧幽深。达芬奇试图将人物的内心同她美丽的外表结合起来，对于能够表现人物感情的眼角和嘴唇，他着重掌握了精确与含蓄的辩证关系，使得蒙娜丽莎的微笑成为了一个千古之谜，很多科学家都将这一微笑形容为“神秘的微笑”。几百年来，人们一直对《蒙娜丽莎》神秘的微笑进行着孜孜不倦的探究。不同的观赏者带着不同的心情，在不同的时间去观赏，感受也会不同。有的人觉得她笑得如阳光般温柔，有的人认为她严肃，有的人会觉得她的笑中带着淡淡的哀愁，有的人甚至觉得她的笑中带着讥嘲和揶揄。画中，光线不能像对雕塑那样产生很大的影响，但在蒙娜丽莎的脸上，似乎有一道阴影时隐时现，这就使得她的双眼与唇部像披上了一层神秘的面纱。表现笑的最明显的是人的嘴角和眼角，但达·芬奇把这两个部位画得若隐若现，没有明显的变化，这样就产生了让人捉摸不定的“神秘的微笑”。而很多学者为解开这一神秘的微笑做了大量的研究，哈佛大学的一位学者指出，蒙娜丽莎微笑的出现并不是因为蒙娜丽莎表情的神秘莫测，而是与人的视觉系统有关。当人们注意蒙娜丽莎眼睛的时候，外观视觉将本来的颧骨的阴影扩大，这样就出现了微笑，而当人们注意她的嘴唇的时候，这个微笑永远无法出现。1993年，加拿大美术史家苏珊·吉鲁公布了一项震惊世人的研究成果，她认为蒙娜丽莎的嘴唇实际上是一个男人的脊背，乍听上去这一说法十分荒诞，但他找出了有力的证据，达芬奇不仅是画家，而且还是雕刻家、建筑师、工程师，当时的人都称他为“怪杰”，因为他非常喜欢穿粉红色的衣服，而且喜欢把胡子涂得五颜六色，而且他还是一个左撇子，喜欢从右到左写字，以至于人们只有借助镜子才能读懂他写的字，苏珊·吉鲁从中得到了启示，于是将镜子旋转了90度之后得出了这一结论。关于蒙娜丽莎的微笑也有很多的争论，有的学者认为他根本没有在微笑，而是在掩盖自己没有长门牙的缺陷；有的人则认为她是因为中过一次风，导致半个脸肌肉松弛，恰巧脸歪着像是在微笑；甚至有的学者细致地观察到她的左右脸不对称，左边脸大于右边脸，进而得出蒙娜丽莎并不是一位女性而是两性的结合体，对于这一问题至今还没有得出结论，但这并不能阻碍《蒙娜丽莎》带来的视觉体验。除了蒙娜丽莎的微笑最能吸引人们的目光之外，还有就是它的背景之谜，人们对于蒙娜丽莎身后的背景莫衷一是，有的学者认为达芬奇所描绘的背景应该是意大利中部阿雷佐市布里阿诺桥。因为达芬奇出生在芬奇镇，距离阿雷佐不远，而且达芬奇曾经在阿雷佐生活过，这一地区的原始景观与《蒙娜丽莎》的背景如出一辙，所以，达芬奇很有可能将这一地区的景色作为《蒙娜丽莎》的背景，这一观点也得到了学术界的一致认同。意大利艺术史学家卡拉·格洛里认为，画中蒙娜丽莎肩上方的背景是意大利北部小镇博比奥大桥和一条路，而在此之前人们普遍认为《蒙娜丽莎》的背景是虚构的。格洛里声称，博比奥确实有这样一条像画中那样蜿蜒曲折的道路，而达芬奇从他居所的窗户可以看到这座拱形大桥。她是在研究《蒙娜丽莎》的真正身份的时候得出的结论，在她看来，画中女子有可能是15世纪米兰公爵卢多维科·斯福尔扎的女儿比安卡·焦万娜·斯福尔扎。但是与此相对的一种说法是，这名女子实际上是意大利佛罗伦萨一名商人的妻子莉萨·焦孔多。当时博比奥在卢多维科治下，那里的图书馆吸引了许多艺术家及科学家，达芬奇很有可能去过那。
达芬奇这一时期深受人文主义思想的影响，所以他非常注重体现人物的内心情感，摒弃了以往的侧面半身或截至胸部的画法，而是采用了正面胸像的构图法，使整个图呈现了一个金字塔的形状，这样蒙娜丽莎就显得格外地端庄大方，达芬奇还将她的手突出出来，丰满、柔嫩足以显示出她的身份，这都需要达芬奇精湛的绘画技艺和细致敏锐的观察力，但细心的游客会发现蒙娜丽莎似乎没有眉毛，人们也一直在猜测达芬奇的良苦用心，但是最近的一项研究发现，在蒙娜丽莎的左眼眉位置有一个眉毛的油墨迹，毕竟蒙娜丽莎已经有几百年的历史，时间总会在她的身上留下印记。一副神秘的画，一个博学的人，达芬奇留给后人的太多太多了。文艺复兴时期，他传播人文主义思想，而现在，他留给后人是视觉上的饕餮盛宴，神秘的《蒙娜丽莎》就是他留给后人的礼物，而他在科学、建筑、雕刻方面取得的成就也是后人望尘莫及的。
文艺复兴巨匠——米开朗琪罗
米开朗琪罗，全名为米开朗琪罗·迪·洛多维科。文艺复兴时期著名的雕塑家、建筑师、画家和诗人，“文艺复兴三杰”之一。他笔下的人物以“健美”著称，即使是柔弱的女性在他笔下也是肌肉健壮。也许是艺术家的缘故，米开朗基罗脾气十分暴躁，即使是他的赞助人，他也会毫不客气地顶撞，但他有自己的艺术追求，一生追求完美，有自己独特的艺术风格，可以说，他的风格几乎影响了之后的艺术家。米开朗琪罗出生在意大利卡森蒂诺的卡普雷赛，父亲是一名法官，母亲在他六岁的时候去世。由于无人照管他，父亲便将他送到一个石匠家，他在那里生活了几年。13岁的时候，他开始跟随多梅尼科·吉兰达约学习绘画，惊人的绘画天赋使得他得心应手，如鱼得水，可惜老师妒忌他的才能，学了一年多之后，他实在忍受不了，便转入到了一所雕塑学校，但因为宗教信仰的冲突，他毅然决然地离开了那里。之后，他来到威尼斯、罗马等名城游学，雕塑水平有了大幅度提高。1505年，枢机主教嫉妒他的才能，唆使教皇让其绘画西斯廷教堂的天顶。此后几年，他几乎成为历任教皇的御用雕刻家，尽管他并不喜欢这一职务，但也没有办法违抗命令。1527年，意大利爆发一场革命，米开朗琪罗被卷入其中并险些丧命。革命结束后，教皇依然再次起用他，米开朗琪罗只好又为自己不喜欢的人工作。当教皇驾崩之后，他以为自己终于解放了，但没想到当他回到罗马后，又被保罗三世“请”去，这似乎就是他的命运-无休止地为别人干活。
1564年2月12号，年事已高的米开朗琪罗还是站了一整天创作《哀悼基督》，14号他便开始身体不适，发着高烧，18日下午5时，这位杰出的雕塑家兼画家与世长辞。
在佛罗伦萨期间，米开朗琪罗因为在洛伦佐开设的雕刻学校表现突出，被允许可以自由出入府邸。在府邸，学者们齐聚一堂，创立了“柏拉图学院”，这一学院的核心就是要将人作为世界的中心，将世界归还给人，将人归还给自己。人有学习艺术、文化、科学的自由，同时，还应该有独立的思想。人应该从封建教条的束缚中解放出来。宗教改革家、修道士萨伏纳罗拉经常在洛伦佐的府邸进行演讲，抨击教会的黑暗，米开朗琪罗经常去旁听，他深深被这位为了拯救人类命运而不怕宗教法庭审判的修道士所折服，人文主义思想在他的身上生根发芽，但洛伦佐去世之后，佛罗伦萨又重新陷入了混乱的境地，米开朗琪罗失去了保护伞，很快离开了这个是非之地，辗转来到了威尼斯和罗马等地。米开朗琪罗来到罗马之后就像进入了雕塑的天堂，罗马到处林立古代雕像，使他有了一次视觉盛宴。法国红衣主教委托年轻的米开朗基罗，为圣彼得教堂制作一座雕像。米开朗琪罗根据当时的一位英雄制作了雕塑《哀悼基督》，这座雕塑使米开朗琪罗名扬罗马， 三年后，米开朗基罗重新回到佛罗伦萨，开始了耗时三年的《大卫》的创作，完成之后将其放在韦吉奥宫正门前，而大卫也一直被佛罗伦萨人视为城市的守护者和民主政府的象征。1505年，教皇朱理二世邀请米开朗基罗在圣彼得教堂内建造陵墓，在陵墓留下了《摩西》和《奴隶》等雕像，米开朗基罗的雕塑天赋受到了教皇艺术总监勃拉曼特的妒忌，他唆使教皇暂停陵墓修建，强烈要求米开朗琪罗完成西斯廷教堂天顶壁画，米开朗基罗凭借自己非凡的艺术才能创造了另一个奇迹——世界上最大的壁画《创世纪》。当41岁的米开朗琪罗重新回到佛罗伦萨，教皇利奥十世又强迫米开朗基罗为洛伦佐陵墓制作雕像，陵墓的石棺上安放着著名的《昼》、《夜》、《晨》、《暮》四座雕像。在米开朗琪罗61岁的时候又被教皇召回罗马，在教堂祭坛的壁面上绘制《末日的审判》。